LightCycler® 480 SYBR Green I Master 是一种用于 PCR 的单组分热启动反应混合物。它包含 FastStart Taq DNA 聚合酶和 DNA 双链特异性 SYBR Green I 染料，用于 PCR 产物检测和表征。由于该混合物作为易于使用的多合一主试剂提供，因此反应设置只需要添加模板DNA和引物。该混合物可与不同类型的 DNA（例如基因组 DNA 或 cDNA）一起使用，适用于 LightCycler® 480 仪器上 96 孔板或 384 孔板的高通量应用。
应用
LightCycler® 480 SYBR Green I Master专为研究而设计。当与 LightCycler® 480 系统一起使用时，该试剂盒非常适合热启动 PCR 应用。结合 LightCycler® 480 系统和合适的 PCR 引物，该试剂盒可以fei常灵敏地检测和定量确定的 DNA 序列。该试剂盒还可用于执行两步 RT-PCR。它也可以与热不稳定的尿mi啶-DNA糖基化酶一起使用，以防止PCR过程中的残留污染。
原则上，该试剂盒可用于扩增和检测任何DNA或cDNA靶标。
原则
LightCycler 480 SYBR Green I Master 是一种即用型反应混合物，专为在 LightCycler®® 480 仪器上应用 SYBR Green I 检测格式而设计。它用于在 96 或 384 多孔板中进行热启动 PCR。热启动PCR已被证明通过在反应开始时最大限度地减少非特异性扩增产物的形成，显着提高PCR的特异性和灵敏度[Chou Q等人，1992和Kellogg DE，等人，1994]。
FastStart Taq DNA 聚合酶是一种化学修饰形式的热稳定重组 Taq DNA 聚合酶，在高达 75°C 的温度下没有活性。 该酶仅在高温下具有活性，其中引物不再非特异性结合。在循环开始之前，酶在单个预孵育步骤（95°C，5 - 10分钟）中wan全激活（通过去除封闭基团）。激活不需要其他热启动技术典型的额外处理步骤。
PCR产物的产生可以通过测量SYBR绿I荧光信号来检测。SYBR Green I插入DNA螺旋（5）。在溶液中，未结合的染料表现出很少的荧光;然而，荧光（波长，530 nm）在DNA结合时大大增强。因此，在PCR过程中，SYBR Green I荧光的增加与产生的双链DNA量成正比。由于SYBR Green I染料非常稳定（在30个扩增循环中只有6%的活性损失），并且LightCycler® 480仪器的光学滤光片组与激发和发射波长相匹配，因此它是测量总DNA的shou选试剂。
在光循环仪® 480系统上进行实时荧光定量PCR期间，使用SYBR Green I进行DNA检测的基本步骤是：
为了证明只有您想要的PCR产物被扩增，您可以在PCR后进行熔解曲线分析。在熔解曲线分析中，反应混合物缓慢加热至97°C，这导致双链DNA熔解并相应降低SYBR Green I荧光。仪器持续监测这种荧光降低，并将其显示为熔解峰。每个熔解峰代表特定DNA产物的特征解链温度（Tm）（其中DNA为50%双链和50%单链）。决定dsDNA的Tm的最重要因素是该片段的长度和GC含量。如果PCR仅产生一个扩增子，则熔解曲线分析将仅显示一个熔解峰。如果存在引物二聚体或其他非特异性产物，它们将显示为额外的熔点峰。因此，检查PCR产物的Tm可以与在凝胶电泳中按长度分析PCR产物进行比较。
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